原代細胞的複蘇步驟

       細胞一般儲(chu) 存在液氮中,溫度達196°C ,理論上儲(chu) 存時間是無限的。細胞凍存及複蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以zuida限度的
保存細胞活力。
細胞複蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細胞恢複到一般的生長狀態,今天我們(men) 來看看原代細胞的複蘇步驟。
一、檢查
收到細胞株包裹時,請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形,若有請立即處理告訴寄方。細胞株請盡速開始培養(yang) , 或立即冷凍保存(置於(yu) -70
。C ,隔夜後,移到iq N2)。

二、冷凍細胞解凍
1、依據細胞株說明書(shu) zhiding的基礎培養(yang) 基種類、血清種類和其它zhiding之成份和比例,製備培養(yang) 基。
絕大多數之細胞均無法立即適應不同基礎培養(yang) 基或不同的血清種類,若因實驗需要,必須有所不同時,務必以緩慢比例漸次改變培養(yang) 基組
成，確定細胞適應後,方進行所需之實驗。
2、FBS (fetal bovine serum,胎牛血清), CS (calfserum,小牛血清)和HS (horseserum,馬血清) ,對細胞而言差異jida,請務必依據細胞株
資料zhiding的血清種類培養(yang) 細胞。
3、將培養(yang) 基置於(yu) 37 °C水槽中回溫,回溫後噴以70 %酒精並擦拭之,移入無菌操作台內(nei) 。取出冷凍管，立即放入37 °C水槽中快速解凍,
水麵高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿,否則易發生汙染。輕搖冷凍管使其在1分鍾內(nei) 全部融化後,以70 % ethanol擦拭冷凍管外部,移入無菌
操作台內(nei) 。
4、依據細胞種類和濃度,於(yu) 無菌操作台內(nei) 取10 ml培養(yang) 基加至T25或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液,緩緩加入T25或T75 flask內(nei)
之培養(yang) 基,混合均勻,放入37°C , 5 % CO2培養(yang) 箱培養(yang) 。
5、對絕大多數細胞而言, 1 %以下之冷凍保護劑DMSO ,不會(hui) 對細胞之貼附或活化有不良影響,不需立刻由解凍細胞中去除,待第二二天確 
定細胞生長或貼附良好後再去除即可。
對極少數因對DMSO敏感或會(hui) 造成細胞分化之細胞,需立即去除DMSO者,則可將解凍後之細胞懸浮液放入5- 10 ml培養(yang) 基中,離心300
xg (約1000 rpm) , 5分鍾,小心移去上清液,加入適量新鮮培養(yang) 基,將細胞均勻混合後,轉移至培養(yang) 瓶中,再放入37°C, 5 % CO2培養(yang) 箱培養(yang)

三、收到T25 flask細胞時的處理方式
1.於(yu) 寄送過程中,為(wei) 避免起泡造成細胞脫落死亡, T25 flask均加滿培養(yang) 基。請檢查flask 外觀,並於(yu) 顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無汙染
現象，若有任何問題,不要打開蓋子,請立即通知細胞實驗室。
2.將原封之T25 flask 靜置於(yu) 37。C，5 % CO2培養(yang) 箱中,使細胞回溫至37。C , 並讓運送過程中少數脫落的細胞可再附著生長。
隔天後,於(yu) 無菌操作箱內(nei) 取出flask內(nei) 之培養(yang) 基, (取出之培養(yang) 基可以再使用) ,僅(jin) 留約5-10ml培養(yang) 基於(yu) flask內(nei) ,依-般培養(yang) 方式再將細胞置
入培養(yang) 箱中,或細胞已長滿盤,則將細胞做傳(chuan) 代培養(yang) 。

四,細胞複蘇注意事項
1、整個(ge) 複蘇過程盡量手腳麻利-些,戰線拉得太長可能影響複蘇效果;
2、由於(yu) “化冰”這一步裏凍存管與(yu) 水溫差太大,尤其是液氮裏來的凍存管,放到水裏可能會(hui) 造成翻江倒海的既視感,所以可以用鑷子夾住
凍存管往水裏摁,這樣即使有炸裂的情況也會(hui) 有水做緩衝(chong) ;
3、取凍存管時要謹防凍傷(shang) ,尤其是夏天,盡管熱也zuihao穿長袖白大褂, -些不經意的動作可能會(hui) 把你的小鮮肉“粘”到冰箱門上;
4、離心這-步也可以在凍存管裏的冰融化後直接進行,也就是直接把凍存管離心,離心後棄去原來的凍存液,然後直接加*培養(yang) 基重懸
細胞,接著把細胞轉到培養(yang) 皿/瓶裏培養(yang) 。這種方法也許不能將DMSO清除得很幹淨,但是基本影響不大。
5、複蘇第二天記得去看看細胞 ,如果狀態還不錯的話就說明複蘇成功