細胞傳代時間經驗技巧

　　養(yang) 細胞的小夥(huo) 伴們(men) 都知道，細胞一定要傳(chuan) 代，因為(wei) 細胞在培養(yang) 過程中不斷的繁殖，數量也隨之增加，然而培養(yang) 皿/培養(yang) 瓶的空間有限，增殖受到抑製，所以必須將一部分細胞移至別的培養(yang) 皿/培養(yang) 瓶，讓細胞有足夠生長空間。

　　細胞傳(chuan) 代也不僅(jin) 僅(jin) 是為(wei) 細胞安一個(ge) 更大的“家"，更重要的，是使星空体育平台官网网址或細胞株進一步增殖，這樣，我們(men) 才能有足夠的細胞做各種各樣的實驗。

　　但是，對於(yu) 傳(chuan) 代的時間，很多小夥(huo) 伴都掌握不好，因為(wei) 對於(yu) 不同的細胞來說，判斷能否開始傳(chuan) 代的標準略有不同，今天，我們(men) 就主要來聊一下，細胞傳(chuan) 代的時間問題。

　　什麽(me) 時候進行細胞傳(chuan) 代?

　　對於(yu) 貼壁培養(yang) 和懸浮培養(yang) 而言，判斷是否需要傳(chuan) 代主要看以下2個(ge) 方麵：

　　• 細胞密度：

　　貼壁培養(yang) 細胞進入對數生長期、未達到匯合狀態時即應進行傳(chuan) 代，正常細胞達到匯合狀態時會(hui) 停止生長 (接觸抑製)，重新接種後需要較長時間才能恢複，轉化細胞即使達到匯合狀態也能繼續增殖，但是在經過大約兩(liang) 個(ge) 倍增時間後通常會(hui) 變質。類似地，

　　懸浮培養(yang) 的細胞進入對數生長期、未達到匯合狀態時也應進行傳(chuan) 代。達到匯合狀態時，懸浮培養(yang) 的細胞會(hui) 聚集成團塊，轉動培養(yang) 瓶時培養(yang) 基會(hui) 變得渾濁。

　　• 培養(yang) 基耗竭：

　　生長培養(yang) 基 pH 值降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細胞代謝的副產(chan) 物。乳酸有細胞毒性，而且 pH 值降低也是細胞生長的不利因素。pH 值改變的速度通常取決(jue) 於(yu) 培養(yang) 體(ti) 係中的細胞濃度，細胞濃度越高，培養(yang) 基耗竭的速度越快。

　　如果發現 pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 單位)，同時細胞濃度增大，則應對細胞進行傳(chuan) 代。

　　細胞傳(chuan) 代時間安排

　　注意，一定要嚴(yan) 格按照預定時間進行細胞傳(chuan) 代，這樣才能確保細胞的生物學行為(wei) 穩定，便於(yu) 監測其健康狀態。

　　要從(cong) 某一接種密度開始逐漸調整細胞接種密度，直到達到適合該細胞的穩定生長速度和產(chan) 量，細胞偏離如此確定的生長模式通常表示細胞健康狀況不佳 (例如：變質、汙染) 或者培養(yang) 體(ti) 係的某一組分功能異常 (例如：未達到最佳溫度，培養(yang) 基過於(yu) 陳舊)。

　　強烈建議大家保留詳細的細胞培養(yang) 記錄，記錄加料和傳(chuan) 代時間、所用培養(yang) 基種類、解離方法、分種率、形態學觀察結果、接種濃度、產(chan) 量和抗生素用法。

　　最好按照傳(chuan) 代時間安排開展實驗和其他非常規操作 (如更換培養(yang) 基種類)，如果您的實驗安排與(yu) 常規傳(chuan) 代時間安排不吻合，則應確保當細胞仍處於(yu) 延滯期或者已經達到匯合狀態、停止生長時，不進行傳(chuan) 代。

　　貼壁細胞傳(chuan) 代流程:

　　以下實驗方案介紹了貼壁細胞和懸浮細胞傳(chuan) 代的一般流程,為(wei) 自己所用的星空体育平台官网网址傳(chuan) 代時，建議您嚴(yan) 格遵守實驗中所有產(chan) 品附帶的操作說明,偏離某種細胞所需的培養(yang) 條件會(hui) 導致細胞表型異常，甚至培養(yang) *失敗。

　　(1)傳(chuan) 代前準備

　　用具紫外照射消毒(30min)：無菌培養(yang) 瓶，15ml離心管，移液管，移液槍，槍頭。

　　倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否需要傳(chuan) 代及細胞需要稀釋的倍數。

　　(2)胰蛋-白酶/EDTA消化

　　從(cong) 培養(yang) 箱中取出待傳(chuan) 代的細胞(將蓋子擰緊)，75%酒精進行瓶口消毒，吸掉培養(yang) 細胞的舊培養(yang) 基，PBS緩衝(chong) 液洗去殘留的舊培養(yang) 基，按25m2/ml消化液比例加入消化液，消化液中EDTA濃度視不同細胞而定。放入顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓後立即拿入超淨台內(nei) ，加入6ml細胞*培養(yang) 基中止消化，消化時間為(wei) 1-5min，具體(ti) 以細胞而議，采用無菌吸管輕輕吹打細胞表麵，注意吹打全部培養(yang) 表麵，可以按照先左右吹打，後上下吹打的方式，取所有的細胞懸液放入幹淨的15ml離心管內(nei) ，每分鍾1000rpm，RT5min。

　　(3)製備細胞懸液及培養(yang)

　　吸取上清液丟(diu) 棄，不要吸到底部的細胞沉澱，向離心管內(nei) 的細胞沉澱加入適量*培養(yang) 基，吹打混勻，吹打過程中盡量不要產(chan) 生氣泡，以1:2的比例進行分瓶。

　　(4)結果觀察

　　第二天觀察細胞情況，細胞培養(yang) 換液時間一般2-3天。

　　(5)注意事項

　　1 嚴(yan) 格無菌

　　2 適度消化：把握好消化液的最佳濃度

　　3 吹打細胞動作要輕柔

　　懸浮細胞傳(chuan) 代流程

　　懸浮細胞傳(chuan) 代就比較容易了，可以直接將培養(yang) 瓶中的液體(ti) 吸掉，隻留下少量，然後加入新鮮培養(yang) 液即可。當細胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較髒時，可以將懸液移到離心管內(nei) ，1000-1500rpm離心3min，棄上清，加入約2ml培養(yang) 液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yang) 液的培養(yang) 瓶中，然後置於(yu) 二氧化碳培養(yang) 箱中培養(yang) 。