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細胞凍存與(yu) 細胞複蘇，是細胞培養(yang) 過程中的常見工作。
細胞凍存，是指將細胞貯存在超低溫環境中，使細胞暫時“冬眠"的技術，在需要的時候再進行複蘇。
細胞複蘇，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細胞快速解凍，並使細胞重新恢複生長的技術。
本文將為(wei) 大家介紹細胞凍存與(yu) 複蘇的技術要點和操作步驟。
細胞凍存篇
凍存原則
細胞凍存原則為(wei) “慢凍"，即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。
如果直接將細胞懸液放在超低溫下快速冷凍，細胞會(hui) 受到冷凍損傷(shang) 而死亡。在凍存液中添加的保護劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇，都起到程序性降溫的作用。
DMSO使用注意事項
DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，延緩溫度下降速度，減少細胞內(nei) 冰晶的形成，從(cong) 而起到保護細胞的作用。
需注意的是，DMSO溶於(yu) 培養(yang) 基時，將釋放大量熱量，所以細胞凍存液需提前配製，不能直接將DMSO加入含有細胞的培養(yang) 基中，避免燙傷(shang) 細胞。
另外，DMSO屬於(yu) 致癌物質，使用時應戴好手套，規範操作。
程序凍存液配方
程序凍存液成分一般由基礎培養(yang) 基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為(wei) 10%~90%，DMSO比例為(wei) 5%~10%。根據普諾賽實驗室細胞培養(yang) 經驗，推薦凍存液配比：55%基礎培養(yang) 基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，難養(yang) 細胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO凍存。
細胞凍存密度
細胞凍存和複蘇過程中，不可避免會(hui) 損失部分細胞，所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助於(yu) 提升細胞複蘇存活率，推薦密度為(wei) 100~300萬(wan) 細胞/mL。
凍存操作方法
方法一：使用程序凍存盒
使用程序降溫盒是最-常用的凍存方法。市麵上的降溫盒有些需要添加異丙醇，有些則不需要。
降溫盒須恢複室溫後再使用。
根據普諾賽實驗室細胞培養(yang) 經驗，使用程序凍存盒凍存效果良好，沒有凍存盒的同學可以參照下文方法二和方法三。
操作步驟
步驟1：配製程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預冷
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：用配製好的凍存液重懸細胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟4：凍存管放入凍存盒，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）
步驟5：凍存管從(cong) 凍存盒取出，轉移至液氮長期保存
▲ 使用凍存盒操作示意圖
方法二：使用無血清非程序凍存液
無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液，無需自己配製，無需降溫盒，大大提升了便捷性。
但是，並非所有細胞都適用於(yu) 這種凍存液，使用前必須做凍存測試，沒問題後再批量應用。
操作步驟
步驟1：從(cong) 冰箱拿出無血清非程序凍存液，待用
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：棄上清，加入適量無血清非程序凍存液，重懸細胞
步驟4：按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中，24h後轉移至液氮長期保存
▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖
方法三：手動梯度降溫
在沒有凍存盒或者非程序凍存液時，可以選擇手動梯度降溫。但手動梯度降溫不適用於(yu) 所有細胞，且效果不穩定，同樣需要先做凍存測試。
操作步驟
步驟1：配製程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預冷
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：用配製好的凍存液重懸細胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟4：凍存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的順序放置
▲ 手動梯度降溫操作示意圖
細胞複蘇篇
細胞複蘇講究“快融"，越快融化，細胞所受損傷(shang) 就越小。細胞複蘇的操作不複雜，但每一步都必須穩紮穩打，才能最大限度地提高複蘇存活率。
細胞複蘇步驟
步驟1：水浴鍋預熱至37℃備用
步驟2：準備15mL離心管，並向其中加入適量培養(yang) 基待用
小貼士：離心管中加入2~9mL的培養(yang) 基，比較難養(yang) 的細胞，可適量增加培養(yang) 基。
步驟3：將細胞凍存管從(cong) -80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴鍋
小貼士：如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠（步行超過1min），要把細胞先置於(yu) 幹冰上，再送至水浴鍋。如果將細胞凍存管直接放在手上或口袋裏，可能導致溫度逐漸回升而產(chan) 生冰晶損傷(shang) 細胞。而將細胞凍存管裝在PE手套中，是為(wei) 了預防汙染。
步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鍾內(nei) 融化
小貼士：這一步越快融化越好，最好能放計時器在旁邊。如果1分鍾內(nei) 沒有融化，可能是凍存液量偏多，或者搖晃力度不夠。
步驟5：用紙巾擦拭水漬，轉移至生物安全櫃。用移液槍吸取細胞懸液，緩慢滴加到步驟2中準備好的離心管
小貼士：當同時複蘇多管細胞時，注意不要弄混。
步驟6：1200rpm離心3分鍾
小貼士：離心是為(wei) 了去除DMSO，對於(yu) DMSO敏感的細胞，必須離心；若複蘇的細胞對DMSO不敏感，步驟6、步驟7可以省略，直接將培養(yang) 基補足至10mL，接種至培養(yang) 器皿中，第二天換液。
步驟7：棄上清，用新鮮培養(yang) 基重懸細胞，接種至新的無菌培養(yang) 器皿中
▲ 細胞複蘇操作示意圖
做完步驟7，細胞就複蘇好了。複蘇的細胞需要一段時間恢複狀態，當複蘇後的細胞密度低於(yu) 80%時，48小時內(nei) 不要換液，待細胞形態、生長速度等恢複正常，再進行細胞傳(chuan) 代等操作。（不要因為(wei) 複蘇後兩(liang) 三天細胞狀態不好就丟(diu) 棄，應耐心等待至少一周。）
當然，細胞複蘇後狀態很好的情況下，可以提前開始後續的細胞培養(yang) 實驗。
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