普諾賽4月直播答疑：常見細胞汙染類型及解決方法

在4月28日開播的“常見細胞汙染類型及解決(jue) 方法"課程中，有很多老師就細胞汙染提出了疑問。我們(men) 篩選出部分代表性問題，並作了詳細解答。

01

Q：在細胞培養(yang) 液中，有種可以遊動的蟲子是什麽(me) 汙染？

A：是細菌汙染。帶鞭毛的細菌就是會(hui) 遊動的。

02

Q：有很多黑點，在原位顫抖，沒那麽(me) 明顯的定向運動，是什麽(me) 汙染？

A：細胞碎片、血清沉澱和有些細菌汙染，都會(hui) 在原位顫抖。前者是原地做不規律的布朗運動，細菌是原地轉動，頻率會(hui) 高很多。

03

Q：血清的絮狀物雜質屬於(yu) 正常現象嗎？

A：血清裏麵有一些大分子蛋白和一些纖維析出，呈現絮狀，也有一些磷酸鈣析出呈現小黑點，這些都是很常見的。沉澱太多，可以離心去掉部分。血清沉澱的多少也跟血清的溶解方式有關(guan) ，溶解過程中最好是4℃，期間不時搖晃進行溶解。根據普諾賽多年培養(yang) 細胞經驗，血清的沉澱多與(yu) 少並不決(jue) 定血清質量。

04

Q：液體(ti) 變微黃、渾濁怎麽(me) 解決(jue) ？

A：這個(ge) 是典型的細菌汙染。如果細胞形態尚且完整，可以嚐試用10%的雙抗清洗去除，或者使用別的抗生素清除，如慶大黴素50U/mL、四環素10μg/mL等；如果細胞狀態已經很差，就沒有挽救的價(jia) 值了。

05

Q：為(wei) 什麽(me) 有的培養(yang) 基天天需要換液呢？

A：正常情況下，是不需要每天換液的。培養(yang) 基橘黃色是細胞比較喜歡的環境，正常是2~3天換一次比較好，換液多了細胞狀態反而容易受影響。如果是因為(wei) 培養(yang) 基異常消耗，才需要每天換液，那麽(me) 我們(men) 要做的是找到異常消耗的原因，是細胞量過多，還是有其他細菌或者支原體(ti) 汙染。先找到原因才能不用每天換液。

06

Q：我凍存的細胞，每次複蘇養(yang) 幾天就汙染了，是什麽(me) 原因呢？

A：如果凍存前就帶進去了汙染，那麽(me) 同一批次的複蘇出來都會(hui) 有汙染。這種情況下，可以在複蘇當天給予抗生素清除（不能用雙抗），如慶大黴素50U/mL、四環素10μg/mL等；如果同一批有複蘇沒有汙染的情況，要考慮複蘇過程，建議換一下水浴鍋的水和其他試劑耗材再複蘇。

07

Q：細胞培養(yang) 不生長，傳(chuan) 代擴不起來，是不是就是支原體(ti) 汙染？

A：支原體(ti) 汙染肉眼是很難區分的，支原體(ti) 汙染會(hui) 導致細胞狀態變差，但是細胞狀態變差並不是都是支原體(ti) 造成的，所以我們(men) 還是要用支原體(ti) 檢測加以區分。

08

Q：培養(yang) 基汙染以後，可以過濾一下繼續使用嗎？

A：不建議繼續使用。培養(yang) 基裏麵可能會(hui) 有殘留的細菌分泌物，比如內(nei) 毒素等，可能會(hui) 影響細胞生長。

09

Q：培養(yang) 箱水盤用什麽(me) 抑菌劑？

A：傳(chuan) 統方法用硫酸銅，但是硫酸銅屬於(yu) 重金屬，還是有一定的毒性的。建議使用水浴鍋安全衛士，安全無毒，可以持續一周無菌狀態。

10

Q：試劑已經全部換新的了，還是一直汙染，是什麽(me) 原因？

A：如果試劑盒耗材全部更換了，還需要排除下凍存前是否有汙染。再就是是否存在操作問題，可考慮換其他人養(yang) 一下試試。

11

Q：懸浮細胞碎片形成的黃團怎麽(me) 處理呢？

A：懸浮細胞碎片形成的黃團可以通過低速離心去除，前提是細胞量一定要夠多，轉速一般可以降低到800rpm左右。離心完上清別急著丟(diu) ，先看下細胞是否已經離心下來，也可以根據細胞大小調節離心轉速。

12

Q：細胞裏麵有一些小方塊一樣的東(dong) 西，是什麽(me) 原因？

A：小方塊一般是結晶類的。可以先用培養(yang) 基或者PBS稀釋溶解後換液，看有沒有改善。

13

Q：放了五個(ge) 月的*培養(yang) 基，出現絮狀懸浮物，但是觀察不是細菌，可以過濾後加點血清繼續使用嗎？

A：不建議繼續使用。絮狀物首先要排除黴菌類的汙染；即使排除了黴菌，完培產(chan) 生絮狀物析出了，也會(hui) 對成分有一定的影響，影響後期培養(yang) 細胞。

14

Q：飼養(yang) 雜交瘤細胞，如果觀察有沒有汙染，大概要在多大倍鏡下觀看？

A：觀察汙染的話400倍鏡就夠了，10X目鏡加40X物鏡。

15

Q：請問貼壁細胞表麵有白膜，培養(yang) 液惡臭，是什麽(me) 原因導致的汙染？

A：有白膜和惡臭應該是有汙染無疑了，還很嚴(yan) 重，具體(ti) 是細菌還是真菌，要結合顯微鏡下的菌體(ti) 形態來進一步區分。

16

Q：細胞汙染後，用10倍雙抗處理後，沒有再長，這時細胞可以凍存嗎？

A：細菌不再生長，恢複正常1%抗生素後一周內(nei) 沒有再長起來，就是清除幹淨了，可以凍存。

17

Q：孵箱中一瓶細胞有黑膠蟲汙染，慢慢地整個(ge) 孵箱都有汙染了，那孵箱怎麽(me) 打掃？

A：把細胞全部轉移走，再用消毒液把培養(yang) 箱全部擦拭一遍；培養(yang) 箱水一定要清理幹淨；培養(yang) 箱角落和表麵都噴上細胞房衛士，關(guan) 閉培養(yang) 箱保持30分鍾，再打開散氣30分鍾，換上幹淨的無菌水就行了。

18

Q：請問培養(yang) 箱滅菌水多久換一次呢？換的時候每次都要90℃滅菌麽(me) ？

A：水浴鍋的滅菌水不加抑菌劑的話，建議是每次複蘇前都更換新的；加了水浴鍋安全衛士，可以一周換一次，水是121℃滅菌20分鍾。

19

Q：液氮有沒有可能汙染？

A：理論上液氮這種極-端的環境裏，是不會(hui) 有生物存活的，細菌凍存也是需要保護劑的。

20

Q：新複蘇的細胞，一天後正常貼壁，但是培養(yang) 液裏懸浮大量的黑色團塊，是什麽(me) 原因呢？

A：可能是有細菌汙染了，還是要結合顯微鏡下的黑團形態來進一步確診。

5月直播課“細胞傳(chuan) 代增殖問題"，將於(yu) 5月26日開播，大家記得關(guan) 注哦~