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bEnd.3 [BEND3] (小鼠腦微血管內(nei) 皮細胞)是從(cong) 來自患有內(nei) 皮瘤的小鼠腦組織中分離的內(nei) 皮細胞，該細胞通過表達多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉錄病毒載體(ti) 感染而轉化。在培養(yang) 時，bEnd.3細胞最常遇到的問題就是細胞形態變化和難消化，本期細胞學堂將幫您逐一解決(jue) 。
細胞形態問題
bEnd.3細胞本身生長較慢，在低密度時會(hui) 呈現不規則細胞形態，高密度時則呈規則纖維狀，所以若在培養(yang) 過程中發現細胞形態異常，則有可能是細胞密度低，建議細胞鋪滿密度較高時傳(chuan) 代。以下為(wei) bEnd.3細胞不同密度培養(yang) 圖片：
低密度（100倍鏡）
中密度（100倍鏡）
高密度（100倍鏡）
消化問題
bEnd.3細胞培養(yang) 時間越長越難消化，培養(yang) 4天傳(chuan) 代，一般消化3-5分鍾；培養(yang) 7天傳(chuan) 代，一般消化5-10分鍾。具體(ti) 消化時間以顯微鏡下觀察細胞狀態為(wei) 準。
培養(yang) 7天，消化5分鍾顯微圖
培養(yang) 7天，消化10分鍾顯微圖
如遇到消化困難不必擔心，可通過分次消化的方式解決(jue) ，具體(ti) 操作方法如下（以T25瓶細胞為(wei) 例）：
吸出原培養(yang) 液；
加入2mL左右PBS，輕輕晃動培養(yang) 瓶潤洗細胞，吸出PBS丟(diu) 棄；
加入1mL左右胰酶，輕輕晃動培養(yang) 瓶使之浸潤所有細胞；
放入培養(yang) 箱消化，消化3-5分鍾（根據具體(ti) 細胞稍作延長或縮短），顯微鏡下看到細胞開始漂浮，可以加入2mLPBS，晃動培養(yang) 瓶使細胞懸浮，不要吹打剩下的貼壁細胞；
吸出培養(yang) 瓶內(nei) 的PBS和細胞懸液，轉移到無菌離心管中，在離心管中加入3mL含血清的培養(yang) 基終止消化並吹散細胞，使細胞盡量呈單顆細胞的懸浮液；
原培養(yang) 瓶中加入0.5mL胰酶，晃動培養(yang) 瓶浸潤細胞，放入培養(yang) 箱繼續消化，直到細胞塊中間全部收縮變圓，晃動培養(yang) 瓶可脫落；
用3mL含血清的培養(yang) 基終止消化，將瓶底的細胞全部吹下，並輕輕吹吸分散細胞呈單顆；
收集細胞懸液與(yu) 第一次消化下來的細胞合並到一個(ge) 離心管；
離心收集細胞沉澱，1200rpm/min 3分鍾，離心完吸出上清丟(diu) 棄；
加入新鮮培養(yang) 基，吹打幾下混勻細胞，按需接種到新培養(yang) 瓶，補足培養(yang) 基，擰鬆瓶蓋或使用透氣瓶蓋進行培養(yang) ；
檢查培養(yang) 箱二氧化碳，溫度和水盤。
培養(yang) 小貼士
01
細胞培養(yang) 過程中形態多樣，低密度時容易出現放射狀細胞，看似已經鋪滿瓶底，其實細胞量較少，需要細胞胞體(ti) 排列緊密的時候進行傳(chuan) 代；
02
細胞培養(yang) 過程中避免頻繁換液，可以每隔2-3天換液或者半量換液一次；
03
培養(yang) 過程中會(hui) 產(chan) 生10%左右活的單顆漂浮細胞，貼壁細胞密度偏低時，注意收集懸浮細胞，貼壁細胞密度偏高時，可以換液時丟(diu) 棄；
04
接種量對細胞生長有影響，接種量過低細胞會(hui) 有增殖緩慢，漂浮過多的現象，請注意控製傳(chuan) 代比例；
05
細胞對溫度和pH較敏感，傳(chuan) 代或換液前培養(yang) 基可以常溫複溫4小時以上；避免使用pH改變（偏酸：顏色偏黃；偏堿：顏色偏紫紅）的培養(yang) 基；
06
細胞傳(chuan) 代過程中若出現單次消化時間過長，可進行分次消化，切不可將細胞強行吹下來，以避免吹打造成細胞機械損傷(shang) 。
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