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脾髒是機體(ti) 重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴細胞，占全身淋巴組織總量的25%，在小鼠中，由於(yu) 小鼠血液量少，從(cong) 外周血液中分離大量淋巴細胞較為(wei) 困難，故經常需要從(cong) 其脾髒中獲取大量的淋巴細胞。
不久前，來自華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院的李老師在Biomaterials雜誌上發布的文章中就用到了上述實驗。以下為(wei) 是李老師分享的一些相關(guan) 經驗。
操作步驟
1 材料準備
選取具有正常免疫功能的成年小鼠（所需的小鼠數量根據實驗需要決(jue) 定，通常一隻小鼠脾髒可提取的淋巴細胞數量為(wei) 2~6×107），快速斷頸處死(避免脾梗死)後，浸泡於(yu) 75%酒精中；準備好已消毒的眼科剪、眼科鑷，以及一個(ge) 裝有一定量PBS的無菌皿，分離脾髒後置於(yu) 皿中，全程無菌操作；
2 小鼠脾髒處理
脾髒細胞數量較少時，可用兩(liang) 個(ge) 1mL無菌注射器的針尖將脾髒戳出大量的空洞後，輕輕刮取脾髒表麵，將脾髒細胞刮出；數量較多時，可用細胞濾網進行研磨後離心，也可得到淋巴細胞。
3 離心
15mL離心管中吸入5mL ficoll分離液，傾(qing) 斜管身，小心吸取含淋巴細胞的PBS緩慢加入ficoll分離液，可見明顯液體(ti) 分層。600rpm梯度離心25分鍾，升速/降速均為(wei) 2；
4 二次離心
得到分為(wei) 3層的液體(ti) , 小心吸取中間層液體(ti) （含淋巴細胞+紅細胞）並置於(yu) 新的15mL離心管，補滿PBS，600rpm離心5分鍾；
5 三次離心
棄上清PBS, 可見黑紅色沉澱，加入1~2mL紅細胞裂解液，冰上裂解5分鍾，補滿PBS, 600rpm離心5分鍾；
6 獲取淋巴細胞
棄上清PBS, 可見白色沉澱，此為(wei) 總淋巴細胞；計數；
7 重懸淋巴細胞
將提前過夜包被CD3抗體(ti) (包被濃度為(wei) 5ug/mL)的96孔板中的PBS吸棄，配製淋巴細胞培養(yang) 基，1640全培+巰基乙醇+CD28抗體(ti) (終濃度2.5ug/mL)，重懸淋巴細胞並加入96孔板，100~200ul/孔，通常淋巴細胞數量為(wei) 1~3×105個(ge) /孔。通常8個(ge) 小時即可看到T細胞增殖團，刺激48h後可以較好活化T淋巴細胞；
8 分選
若實驗目的為(wei) 分選CD4/CD8 T淋巴細胞，可以省去紅細胞裂解操作，直接用磁珠抗體(ti) 對淋巴細胞進行避光孵育，並用PBS洗掉多餘(yu) 的試劑後，棄上清，用一定量PBS重懸淋巴細胞，緩慢加入預先潤濕過的macs tube(已安裝到磁力架上)。根據具體(ti) 試劑和目的可以分為(wei) 陰選和陽選：陰選需要從(cong) 分選柱中流下的液體(ti) ，其中含有目的細胞；陽選則應該等待分選柱中的液體(ti) 流盡後，將分選柱從(cong) 磁力架上取下後，並重新加入PBS將分選柱中的陽選細胞衝(chong) 下，其中含有目的細胞。計數，此後步驟同總淋巴細胞。
注意事項
1
由於(yu) 整個(ge) 過程需要淋巴細胞長時間處於(yu) 體(ti) 外PBS中，所以對PBS的要求比較嚴(yan) 格；為(wei) 保護淋巴細胞，也可以使用專(zhuan) 門的淋巴細胞緩衝(chong) 液，或自行配製含0.4%BSA的PBS緩衝(chong) 液；
2
有些研究為(wei) 了更好地促進淋巴細胞的殺傷(shang) 功能，還會(hui) 在T細胞培養(yang) 基中添加IL-2; 但是，很多人認為(wei) 這樣也會(hui) 加速T細胞進入T細胞耗竭的進程，同時會(hui) 縮短T細胞壽命；
3
若後續需要進行流式分析，無法再染CD3 和 CD28分子；
4
若用到了OT-I CD8 T細胞，則無需CD3抗體(ti) 刺激，而是用OVA抗原刺激活化第一信號；
5
以上所有操作均以無菌試劑、耗材，無菌環境內(nei) 操作為(wei) 前提。
以上為(wei) 淋巴細胞提取、分選的經驗分享，希望對大家有所幫助。同時也歡迎更多老師參與(yu) 文獻獎勵活動，分享您的科研幹貨和心得體(ti) 會(hui) ！
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