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核酸適體(ti) 是一段能特異性識別靶標分子的單鏈DNA或RNA，已被廣泛用於(yu) 各種生物醫學應用。然而，由於(yu) 適體(ti) 的構象動態易變，抗環境幹擾能力弱，從(cong) 而影響與(yu) 靶標的結合親(qin) 和力以及核酸適體(ti) -靶標複合物的穩定性，因此與(yu) 商業(ye) 抗體(ti) 相比，核酸適體(ti) 在檢測和治療方麵的性能通常一般。
湖南大學化學生物傳(chuan) 感與(yu) 計量學國家重點實驗室的王丹博士為(wei) 我們(men) 闡述了如何合理地設計親(qin) 電標簽功能化的核酸適體(ti) 通過點擊化學的共價(jia) 偶聯技術實現新-冠病毒的靈敏檢測和侵染阻斷，進一步推動了適體(ti) 在診斷、分子成像、疾病治療和其他生物醫學領域的應用。該研究於(yu) 2023年1月2日發表於(yu) 國際知-名雜誌ACS Central Science (IF=18.2)，題為(wei) Robust Covalent Aptamer Strategy Enables Sensitive Detection and Enhanced Inhibition of SARS-CoV-2 Proteins。
圖1 該研究發表於(yu) 國際期刊ACS Central Science
01
研究背景
為(wei) 了提高結合適體(ti) 親(qin) 和力並減少其與(yu) 靶標複合物的解離，人們(men) 開發了二價(jia) 或多價(jia) 適體(ti) 的分子組裝策略，以及將疏水基團整合到適體(ti) 中以增加結合能力的分子工程策略。然而，這些策略沒有改變適體(ti) 和靶標之間的非共價(jia) 結合模式，對核酸適體(ti) 的結合親(qin) 和力以及核酸適體(ti) -靶標複合物穩定性的提升有限。目前共價(jia) 核酸適體(ti) 的概念和應用還處於(yu) 起步階段，並沒有被廣泛開發和認識。因此，促進共價(jia) 核酸適體(ti) 概念的開發和擴大共價(jia) 核酸適體(ti) 的應用領域將是非常重要的。
02
工作設計
為(wei) 解決(jue) 上述問題，作者將三種親(qin) 電性官能團與(yu) 核酸適體(ti) 偶聯以開發共價(jia) 核酸適體(ti) ，作為(wei) SARS-CoV-2 蛋白的檢測探針和功能性阻斷中和劑(圖2)。三種共價(jia) 核酸適體(ti) 分別為(wei) 硫酰氟修飾的適體(ti) (SF-Apt)，N-羥基琥珀酰亞(ya) 胺修飾的適體(ti) (NHS-Apt)以及丙烯酰胺修飾的適體(ti) (Acr-Apt)。作為(wei) 概念驗證，作者選擇SARS-CoV-2的核衣殼蛋白 (NP) 和刺突蛋白受體(ti) 結合域 (RBD)作為(wei) 研究對象探究共價(jia) 核酸適體(ti) 性能。NP 是 SARS-CoV-2 最保守和最-豐(feng) 富的結構蛋白，是早期檢測和可靠診斷的最-佳選擇。RBD是SARS-CoV-2識別和感染宿主ACE2蛋白的關(guan) 鍵蛋白。
圖2 基於(yu) 共價(jia) 適配體(ti) 的策略，通過特異性
近距離交聯來檢測和阻斷靶蛋白
03
研究結果
NO-1
候選共價(jia) 適體(ti) 的合成和表征
首先，作者選擇了3種親(qin) 電能力各異的共價(jia) 標簽，合成了三種備選的共價(jia) 核酸適體(ti) 。然後通過凝膠電泳實驗綜合分析了交聯反應效率、特異性和速率，發現中等親(qin) 電能力的NHS標記的共價(jia) 核酸適體(ti) 表現最佳，將其選為(wei) 後續應用的探針。(圖3)
圖3 三種候選共價(jia) 適配體(ti) 的合成和表征
NO.2
N蛋白共價(jia) 適體(ti) 的性能表征
然後作者測試了共價(jia) 核酸適體(ti) 、傳(chuan) 統核酸適體(ti) 以及抗體(ti) 與(yu) NP的親(qin) 和力。結果表明：與(yu) 傳(chuan) 統核酸適體(ti) 相比，共價(jia) 核酸適體(ti) 的解離速率常數Koff降低了2個(ge) 數量級左右，親(qin) 和力(Kd)提高了30-60倍左右，與(yu) 抗體(ti) 相當甚至優(you) 於(yu) 抗體(ti) 。共價(jia) 適體(ti) -NP複合能耐受多次洗滌、EDTA和尿素等環境因素的幹擾，且對靶蛋白的結合具有優(you) 異的選擇性。(圖4)
圖4 共價(jia) 適配體(ti) 策略具有更強的抗環境
幹擾能力和更高的特異性結合能力
NO.3
基於(yu) 共價(jia) 適體(ti) 的N蛋白ELISA檢測
接下來，作者比較了共價(jia) 核酸適體(ti) ELISA、核酸適體(ti) ELISA和抗體(ti) ELISA檢測NP的性能。在嚴(yan) 格洗滌條件下，共價(jia) 核酸適體(ti) ELISA的檢測限(8.70pg/mL)和線性範圍(81–2187pg/mL)均優(you) 於(yu) 抗體(ti) ELISA的檢測限(70.0pg/mL)和線性範圍(81–19683pg/mL)。另外，在嚴(yan) 格的洗滌條件下，共價(jia) 核酸適體(ti) ELISA具有更好的檢測特異性。(圖5)
圖5 在不同的洗滌緩衝(chong) 液下使用各種探針檢測NP
NO.4
RBD蛋白共價(jia) 適體(ti) 的性能表征
接著，作者研究了RBD共價(jia) 適體(ti) 的結合和交聯性能。研究發現RBD適體(ti) 偶聯上NHS標簽後，親(qin) 和力提高了25倍，結合速率顯著提升且從(cong) 靶標處的脫落速率顯著下降，此外共價(jia) 核酸適體(ti) 在生理Mg2+濃度下也能高效結合RBD蛋白。這十分有利於(yu) 共價(jia) 適體(ti) 對新-冠病毒蛋白的中和和新-冠病毒的侵染阻斷。(圖6)
圖6 共價(jia) 交聯提高適配體(ti) 的結合性能並減少靶標結合處的脫落
NO.5
共價(jia) RBD核酸適配體(ti) 的結合能力
最後，作者研究了共價(jia) 核酸適體(ti) 、抗體(ti) 和核酸適體(ti) 阻斷RBD與(yu) ACE2結合的能力。結果表明共價(jia) 核酸適體(ti) 阻斷RBD-ACE2結合的能力(IC50=0.42nM)顯著優(you) 於(yu) 與(yu) 抗體(ti) (IC50=1.19nM)和核酸適體(ti) (IC50=21.5nM)，結合速率更快且脫落速率更慢。因此，在模擬血管和剪切應力的循環流動裝置中，共價(jia) 核酸適體(ti) 比抗體(ti) 和核酸適體(ti) 具有更強的能力阻斷RBD和ACE2的結合。在新冠假病毒中和實驗中，共價(jia) 核酸適體(ti) 的半數中和濃度僅(jin) 需約2nM, 最高中和效率達到95%，對比之下，抗體(ti) 的半數中和濃度約6nM, 最高中和效率83%。(圖7)
圖7 共價(jia) 交聯策略提高了RApt惡劣環境下介導的阻斷能力
04
結論和展望
2022年的Nobel化學獎頒給了點擊化學和生物正交化學，本研究正是利用活性很高的“Click"基團，並基於(yu) 鄰近驅動的共價(jia) 偶聯策略實現了對新-冠病毒的靈敏檢測和高效中和。共價(jia) 策略通過將適體(ti) 與(yu) 靶蛋白之間的非共價(jia) 結合模式轉化為(wei) 共價(jia) 結合模式，增強了識別能力並降低了解離速率，能進一步推動適體(ti) 在診斷、分子成像、疾病治療和其他生物醫學領域的應用。這項研究得到了國家自然科學基金、 國家重點研發計劃、浙江省自然科學基金、中國博士後科學基金和德國亞(ya) 曆山大·洪堡研究基金的資助和支持。
本研究所用普諾賽產(chan) 品
產(chan) 品名稱 | 產(chan) 品貨號 |
L-穀氨酰胺溶液(200mM)，100× | PB180420 |
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