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細胞學堂 | 微血管內皮細胞知識盤點

更新時間：2023-10-23  |  點擊率：1745


微血管內(nei) 皮細胞（microvascular endothelial cells,MVECs）構成了血液與(yu) 組織液之間的物理屏障，而且在機體(ti) 的凝血與(yu) 抗凝血、致炎與(yu) 抗炎及免疫應答等方麵起著十分重要的作用，其體(ti) 外培養(yang) 模型廣泛應用於(yu) 相關(guan) 研究。但由於(yu) 不同組織器官的微血管內(nei) 皮細胞之間存在較大的異質性，同時微血管內(nei) 皮細胞因解剖部位不同，在形態學、表型和功能上等方麵也存在明顯異質性，不同來源的血管內(nei) 皮細胞之間是不可相互替代的，主要包括腸、肺、心髒、腦、脈絡膜、視網膜、真皮微血管內(nei) 皮細胞等。





本期細胞學堂為(wei) 大家整理了微血管內(nei) 皮細胞的提取、培養(yang) 和鑒定方法及步驟，幫助您快速上手開展實驗。





提取方法




微血管內(nei) 皮細胞的提取和培養(yang) 有酶消化培養(yang) 法、組織塊培養(yang) 法、免疫磁珠法。





酶消化培養(yang) 法

采用消化酶將對應組織內(nei) 細胞間質如基質、膠原蛋白、纖維蛋白等解離，使細胞分散，形成單細胞懸液後再接種進行培養(yang) 的方法。

主要包括：實驗動物及日齡的選擇(根據取材部位決(jue) 定動物日齡）→對應部位的取材→組織的剪碎及清洗→加酶消化→離心去酶→計數後接種培養(yang) →細胞純化→細胞鑒定；



組織塊培養(yang) 法

是將從(cong) 體(ti) 內(nei) 取出的組織剪切成一定大小的組織塊後，接種於(yu) 培養(yang) 瓶進行的培養(yang) 。

主要包括：試驗動物及日齡的選擇(根據取材部位決(jue) 定動物日齡）→對應部位的取材→組織的剪切→接種培養(yang) 。



免疫磁珠法

通過在磁珠表麵包被具免疫反應性的抗體(ti) 進行抗原抗體(ti) 反應，篩選或去除所標記的細胞，達到陽性或陰性選擇細胞的目的。

主要包括：實驗動物及日齡的選擇(根據取材部位決(jue) 定動物日齡）→對應部位的取材→組織的剪碎及清洗→加酶消化→離心去酶→加入磁珠與(yu) 細胞孵育→磁珠磁力架分選→收集沉澱技計數→接種培養(yang) 。




大鼠肺微血管內皮細胞提取示意圖


大鼠肺微血管內(nei) 皮細胞提取示意圖[1]





各種提取方法的優(you) 劣勢

酶消化

培養(yang) 法

可以在短時間內(nei) 得到大量細胞，但是操作繁瑣，易汙染，純化步驟多，需要使用昂貴的膠原酶，導致成本偏高，並且酶濃度和消化時間需要摸索；

組織塊

培養(yang) 法

成功率較高，成本低，適合於(yu) 組織量少的原代培養(yang) ，但是細胞遷出時間不好把握且組織塊去除不徹-底會(hui) 造成其它雜細胞汙染；

免疫

磁珠法

得到的細胞純度高，但是成本高，需要較多的細胞以備篩選和純化。







注意事項


1

試驗動物的日齡和健康狀態可能會(hui) 影響目的細胞的活性、代次；

2

取材部位的分離需要盡可能多的剔除多餘(yu) 組織以及保證無菌；

3

得到大小適中、容易貼壁的組織塊是分離細胞的關(guan) 鍵；

4

采用吹打法時，吹打管的規格、吹打的次數會(hui) 直接影響細胞貼壁能力和細胞的純度；

5

雖然各種酶的消化活力有一定的組織特異性，但由於(yu) 任一組織器官均不是由單一的組織細胞成分構成，因此酶消化液常根據所分離培養(yang) 細胞的種類等因素進行篩選；

6

采用酶消化法時，消化時間和溫度的控製也特別重要。消化時間過長、溫度過高不利於(yu) 細胞的貼壁和伸展；消化時間過短、溫度過低則達不到組織分離的目的；

7

建議使用內(nei) 皮細胞專(zhuan) 用培養(yang) 基，培養(yang) 基含有內(nei) 皮細胞培養(yang) 所需的微量元素、生長因子等；

8

建議包被處理（比如PLL、明膠等），促進內(nei) 皮細胞貼壁，形態立體(ti) ；

9

對於(yu) 大部分細胞來說，同一種細胞，大鼠類的細胞代次會(hui) 比小鼠細胞代次略高；


10

隨著傳(chuan) 代的增加，細胞的形態會(hui) 發生變化。






鑒定指標





顯微鏡觀察鑒定


可以初步觀察細胞形態和生長規律，細胞呈鵝卵石典型的鋪路石樣、多角形、梭形，細胞核大而清晰；



貼塊法獲取的肺微血管內皮，呈鋪路石樣

貼塊法獲取的肺微血管內(nei) 皮，呈鋪路石樣



貼塊法獲取微血管內皮細胞後進行消化轉瓶，消化轉瓶或者傳代後細胞形態有變化

貼塊法獲取微血管內(nei) 皮細胞後進行消化轉瓶，消化轉瓶或者傳(chuan) 代後細胞形態有變化





大鼠腦微血管內皮細胞提取過程[2]

大鼠腦微血管內(nei) 皮細胞提取過程[2]



特異性標誌


目前使用較多的是FactorⅧ、 vWF、和CD31的陽性表達。




●參考文獻●

[1]白祥慧，鄒登朗，祁得勝，等. 大鼠肺微血管內(nei) 皮細胞培養(yang) 方法研究進展[J].畜牧獸(shou) 醫科學，2021.

[2]張帆. 單篩過濾法體(ti) 外分離培養(yang) 原代大鼠腦微血管內(nei) 皮細胞及其鑒定[J].中國組織化學與(yu) 細胞化學雜誌，2023.

[3]段佳熙，巨噬細胞外泌體(ti) 介導慢阻肺微血管內(nei) 皮細胞凋亡及其機製研究[D].中南大學，2022.

[4]免疫磁珠法分離培養(yang) 小鼠原代骨骼肌微血管內(nei) 皮細胞及鑒定[J].心髒雜誌，2023.

[5]Wong E，Nguyen N，Hellman J.Isolation of primary mouse lung endothelial cells[J].J Vis Exp，2021，（177）：e63625.

[6]Sokol L，Geldhof  V，Garcia-Caballero M，et al.Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues:Small intestine,colon,heart,and liver[J].STAR Protoc，2021,2（2）：100489.