直播答疑 | 懸浮細胞培養要點解析

Q1

傳(chuan) 代時，細胞密度比較低，但是培養(yang) 基又

變黃了，怎麽(me) 辦？

細胞培養(yang) 過程中，如發現細胞量較少，但培養(yang) 基變黃較快，可以從(cong) 以下3個(ge) 方麵進行排查：

▶ 檢查培養(yang) 基成分是否正常，如NaHCO₃濃度是否偏低；

▶ 檢查培養(yang) 箱內(nei) CO₂濃度是否過高，一般培養(yang) 基添加濃度為(wei) 1.5g/L或2.2g/L的NaHCO_3，使用5% CO₂進行平衡；添加濃度為(wei) 3.7g/L的NaHCO₃可使用10% CO₂進行平衡；

▶ 是否存在某種汙染物，與(yu) 細胞競爭(zheng) 營養(yang) ，導致培養(yang) 基快速消耗。一般先排除細菌和真菌汙染，通過培養(yang) 法檢查即可（不加抗生素培養(yang) 檢查），如排除細菌和真菌汙染，可進行支原體(ti) 檢測，確定是否存在支原體(ti) 汙染。

Q2

半換液算傳(chuan) 代嗎？怎麽(me) 計算代數？

對於(yu) 有限傳(chuan) 代的細胞，細胞的代次可以用以下公式進行計算：

其中X為(wei) 傳(chuan) 代前代次 ; I 為(wei) 細胞接種前細胞數；Y 為(wei) 培養(yang) 後細胞總數

對於(yu) 腫瘤細胞或無限傳(chuan) 代的細胞，傳(chuan) 代數僅(jin) 僅(jin) 代表操作的次數，與(yu) 傳(chuan) 代比例和細胞增殖數量沒有直接關(guan) 係；

半量換液的細胞，如果沒有進行分瓶培養(yang) ，建議按照常規的換液來計算，不計入傳(chuan) 代次數，如加入新鮮培養(yang) 基後分瓶培養(yang) ，則可以將傳(chuan) 代數+1。

Q3

本來成團生長的細胞，不成團了怎麽(me) 辦？

細胞是否成團生長，一般是跟細胞本身特性以及培養(yang) 環境有關(guan) 的。

如果是本來成團生長的細胞，分散不成團，且增殖速度變慢，可能是細胞狀態變差的症狀。一般可以從(cong) 是否汙染（特別注意支原體(ti) 檢查）、細胞培養(yang) 基或血清是否變更以及操作過程是否對細胞產(chan) 生損傷(shang) 這三個(ge) 方麵進行排查。

如果細胞僅(jin) 僅(jin) 是變成分散狀態，但是生長指標都正常，則可能是由於(yu) 培養(yang) 條件或環境改變導致的，隻要細胞生長正常且沒有其他異常症狀，不需要過度關(guan) 注。

Q4

懸浮細胞複蘇4-5天進行凍存會(hui) 影響

細胞活率嗎？

細胞是否適合凍存取決(jue) 於(yu) 細胞的生長狀態，用於(yu) 凍存的細胞一般要求狀態良好，並處於(yu) 快速增殖階段。

對於(yu) 生長速度較快的懸浮細胞，4-5天可以傳(chuan) 代1-2次，狀態基本恢複，保證細胞處於(yu) 生長旺盛的對數生長期即可凍存；

但是對於(yu) 生長速度慢的細胞，4-5天細胞可能還處於(yu) 狀態恢複中，沒有大量增殖，此時凍存可能會(hui) 影響後續複蘇的狀態。建議複蘇後的細胞，培養(yang) 1-2代，細胞狀態良好時進行凍存。

Q5

培養(yang) THP-1細胞兩(liang) 周，培養(yang) 液很容易變

黃，聚團很嚴(yan) 重，中間有黑渣渣，怎麽(me) 辦？

如果細胞量沒有明顯增加，培養(yang) 基很容易變黃，黑點多且細胞聚團嚴(yan) 重，懷疑細胞是存在某種汙染，需要排除汙染源後重新培養(yang) 。

Q6

THP-1有少量貼壁細胞怎麽(me) 處理？

如果出現少量貼壁，每次傳(chuan) 代培養(yang) 時，隻收集懸浮部分即可；如果需要完-全不貼壁，可以選擇低吸附的培養(yang) 瓶進行培養(yang) 。

Q7

培養(yang) 幾天後，懸浮細胞的培養(yang) 基是不是

會(hui) 變渾濁些？

懸浮細胞和貼壁細胞不一樣，培養(yang) 上清是略顯渾濁的，隨著細胞量的增加渾濁度也會(hui) 增加。

可以通過鏡檢結果來與(yu) 細菌等汙染物進行區分，鏡檢細胞懸液，細胞間隙應該是幹淨的，但汙染的細胞間隙一般是大量黑色顆粒，有些可以觀察到明顯的運動。

Q8

THP -1細胞量挺多，但培養(yang) 基長時間不

變黃，有什麽(me) 辦法？

培養(yang) 基是否變黃隻是細胞傳(chuan) 代的參考指標。培養(yang) 基變黃主要是細胞代謝產(chan) 物積累導致，同時也會(hui) 受到培養(yang) 基的緩衝(chong) 體(ti) 係以及培養(yang) 箱CO₂濃度的影響。如果細胞生長正常，並且到了傳(chuan) 代的量，則可以正常傳(chuan) 代。

對於(yu) THP-1細胞來說，如果細胞數量足夠但是培養(yang) 基不變黃，可能是由於(yu) 細胞接種時培養(yang) 基pH值偏高（可能是培養(yang) 基開啟時間過長，CO₂溢出導致的pH值升高），細胞數量雖多但沒有明顯代謝和增殖，所以顏色不容易變黃。所以建議不要直接分瓶，可以換用新鮮培養(yang) 基繼續觀察。

Q9

Sf9細胞靜置培養(yang) 時正常，轉入搖瓶懸浮

培養(yang) ，停滯不長，但也沒死，是培養(yang) 基不

適合懸浮培養(yang) 嗎？

細胞培養(yang) 條件的變更，如更換培養(yang) 基，或者由靜置培養(yang) 轉為(wei) 搖瓶培養(yang) ，都需要一個(ge) 馴化和適應的過程。

馴化過程，簡單說就是緩慢更換培養(yang) 條件，如將新舊培養(yang) 基按比例混合，讓細胞逐步適應，或者在搖瓶培養(yang) 前期，調低搖床轉速，讓細胞逐漸適應。將細胞直接轉入新的培養(yang) 基或培養(yang) 環境可能導致細胞不長甚至死亡的情況。