細胞學堂 | 大鼠骨髓間充質幹細胞的分離提取

更新時間：2024-02-19 | 點擊率：1470

骨髓間充質幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來源於(yu) 中胚層，是具有多分化潛能的細胞。細胞生物學表明，BMSCs具有較強的增殖能力和多向分化潛能。在不同誘導條件下，可向中胚層細胞如脂肪細胞、成骨細胞、肌細胞等分化。BMSCs 是理想的種子細胞來源之一，在細胞替代治療、基因治療及組織器官再造中具有重要的臨(lin) 床應用價(jia) 值。

本期細胞學堂為(wei) 大家整理了大鼠骨髓間充質幹細胞分離提取的方法、注意事項及鑒定指標，幫助您快速上手開展實驗。

分離提取步驟

骨髓取材

將大鼠斷頸處死後, 置於(yu) 75%醫用酒精內(nei) 浸泡5~10 min，消毒後將動物轉運至超淨工作台內(nei) 。無菌分離雙側(ce) 股骨和脛骨，用新的剪刀鑷子清除股骨脛骨周圍肌肉組織；保持骨頭完整，留取純淨骨頭，將組織轉移至新的含有PBS的培養(yang) 皿內(nei) ，剪去骨幹的兩(liang) 端, 暴露骨髓腔；取注射器，吸取培養(yang) 基，從(cong) 骨頭一端插針，衝(chong) 洗骨髓（至骨頭發白透亮），反複吹打製成單細胞懸液。

分離方法

BMSCs常見的分離方法有密度梯度離心法、貼壁法以及免疫磁珠分選法，大家可以根據自己實驗室條件來選擇合適的分離方法。

密度梯度離心法

將裝有大鼠骨髓液的15 mL離心管，1500 rpm離心5 min；棄上清，用完-全培養(yang) 基重懸沉澱；將培養(yang) 基重懸的細胞懸液緩慢滴加到Percoll分離液（用PBS稀釋）上方，形成密度梯度分離液；2000~2500 rpm離心25 min，吸取中間層的白色霧狀細胞層，加入PBS清洗細胞，1800 rpm離心5 min；棄上清，保留細胞沉澱；用細胞完-全培養(yang) 基重懸沉澱，將細胞懸液按1×10⁶/mL密度接種於(yu) T25瓶中，於(yu) 37℃，5%CO₂恒溫培養(yang) 箱中靜置培養(yang) 。首-次2 d換液，棄去未貼壁細胞, 此後每2~3 d換液一次；待細胞融合達80%後, 用胰酶消化1~2 min後傳(chuan) 代培養(yang) 。

貼壁法

也稱全骨髓培養(yang) 法或一步法。將收集的骨髓懸液經200目篩網過濾後，用完-全培養(yang) 基製成單細胞懸液；培養(yang) 48 h首-次換液，棄去未貼壁細胞；此後每2~3 d換液一次，觀察細胞的生長及融合程度，待細胞融合80%以上後開始傳(chuan) 代培養(yang) 。

流式細胞儀(yi) 或免疫磁珠分選法

免疫磁珠法和流式細胞儀(yi) 分選法通過識別細胞表麵特異性抗原分離細胞，可獲得純度較高的細胞，但對細胞的活性影響較大，獲得的細胞量少，需要特殊的儀(yi) 器，實際應用受限。

注意事項

取材嚴(yan) 格無菌操作。除基本的無菌要求外, 在剪取大鼠的雙下肢及剝離皮毛後，應更換取材器械，避免取材和分離骨髓間的交叉汙染；

培養(yang) 基營養(yang) 要充足。血清濃度可摸索調整，培養(yang) 時可額外添加生長因子；

采用密度梯度離心法時， Percoll分離液最好是現配現用。此外，分離液和細胞懸液的比例應合適，一般采用 1∶1；

注意細胞接種密度、換液時間。密度過低會(hui) 影響細胞貼壁、融合。不同的操作方法中換液、傳(chuan) 代時間各異，根據細胞生長狀況及時調整換液、傳(chuan) 代時間。

鑒定指標

細胞形態學觀察

剛分離提純的原代細胞形態呈圓形，大小不一，漂浮於(yu) 培養(yang) 液中（圖1）。經純化貼壁後可見，細胞呈成纖維樣緊密排列，漩渦樣生長，胞核大、清晰、呈長梭形，細胞形態趨於(yu) 統一（圖2），其形態符合BMSCs 的貼壁形態。