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細胞凋亡（Apoptosis），作為(wei) 一種深入研究的程序性細胞死亡形式，近年來已成為(wei) 生物學領域的熱門課題。如果你的研究涉及癌症機製與(yu) 療法、藥物篩選與(yu) 藥理作用、生物發育、免疫學或神經科學等領域，細胞凋亡檢測無疑是你實驗設計中重要的一環。
在本期的細胞學堂中，我們(men) 將深入介紹不同類型凋亡檢測試劑盒的相關(guan) 知識，並分享一些關(guan) 於(yu) 如何選擇凋亡檢測試劑盒的經驗，旨在幫助您輕鬆理解並為(wei) 您的樣本選擇合適的凋亡檢測試劑盒。
凋亡細胞在細胞形態和生理上與(yu) 壞死細胞和正常細胞存在顯著不同，其細胞膜、細胞質、細胞核、核酸以及凋亡相關(guan) 蛋白都發生明顯變化，具有鮮明特征。這些差異為(wei) 我們(men) 提供了檢測細胞凋亡的多種方法。常用的細胞凋亡檢測方法包括形態學觀察、細胞膜磷脂外翻檢測、凋亡相關(guan) 蛋白檢測、DNA斷裂檢測、細胞周期分析等。這些方法各有特點，可以根據實驗需求和條件選擇合適的檢測方法。
根據細胞凋亡的機製和特點，普諾賽®自主研發了Annexin V凋亡檢測試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒、Caspase活性檢測試劑盒和線粒體(ti) 膜電位(JC-1)檢測試劑盒。
檢測原理：Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，與(yu) 磷脂酰絲(si) 氨酸（PS）有高度親(qin) 和力。在正常細胞中，PS通常位於(yu) 細胞膜內(nei) 側(ce) 。然而，當細胞發生凋亡時，細胞膜的通透性會(hui) 發生變化，細胞膜內(nei) 側(ce) 的PS部分外翻，暴露到細胞膜外側(ce) 。Annexin V可通過與(yu) 凋亡早期細胞胞外翻的PS結合，從(cong) 而識別凋亡細胞。為(wei) 了更便於(yu) 檢測，將Annexin V標記上熒光染料，可通過流式細胞儀(yi) 或熒光顯微鏡等設備檢測到帶有熒光的凋亡細胞。細胞核染料（PI、DAPI、7-AAD）可與(yu) 雙鏈DNA特異性結合，並產(chan) 生強烈的熒光。正常情況下大分子的核染料是無法透過細胞膜，由於(yu) 凋亡晚期或壞死細胞膜喪(sang) 失完整性，細胞核染料可進入細胞內(nei) 對DNA進行染色，與(yu) Annexin V搭配使用，可區分處於(yu) 不同凋亡時期的細胞。
檢測原理：在細胞凋亡的晚期，染色體(ti) DNA雙鏈斷裂產(chan) 生大量的粘性3'-OH末端。在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，脫氧核糖核苷酸與(yu) 熒光素等標記物形成的衍生物可以被標記到斷裂DNA的3'-末端，從(cong) 而進行凋亡細胞的檢測。
檢測原理：Caspase是一個(ge) 蛋白酶家族，通常以無活性的酶原形式存在於(yu) 細胞質中。活化的Caspase會(hui) 破壞一些重要的胞內(nei) 蛋白，從(cong) 而引發凋亡的發生。將Caspase序列特異性的多肽酶偶聯至黃色基團pNA作為(wei) 底物，當Caspase被活化後，它能夠剪切這個(ge) 底物，釋放出遊離的黃色基團。通過酶標儀(yi) 或分光光度計測定這些黃色基團的吸光值，就可以定量評估Caspase的活性，從(cong) 而間接地監測細胞凋亡的情況。
檢測原理：在正常細胞中，線粒體(ti) 膜電位通常較高，JC-1主要在線粒體(ti) 基質中聚集，以聚合體(ti) 的形式存在，可產(chan) 生紅色熒光。然而，在細胞凋亡的早期階段，線粒體(ti) 膜電位會(hui) 顯著降低，導致JC-1無法在線粒體(ti) 基質中積累，主要以單體(ti) 形式存在，可產(chan) 生綠色熒光。通過JC-1從(cong) 紅色熒光到綠色熒光的轉變可檢測到細胞膜電位的下降，可將JC-1熒光顏色的轉變作為(wei) 細胞凋亡早期的檢測指標。
目前市售的凋亡檢測試劑盒種類眾(zhong) 多，如何選擇一款匹配自己檢測樣本和實驗條件的試劑盒至關(guan) 重要。以下是兩(liang) 點可供參考的建議：
01
基於(yu) 樣本類型選擇
根據具體(ti) 實驗設計和樣本類型，選擇合適的凋亡檢測試劑盒。推薦您參考下方表格所示的內(nei) 容，以便為(wei) 您的樣本類型選擇適當的凋亡檢測試劑盒。例如懸浮細胞或經消化下來的貼壁細胞，四種凋亡試劑盒都可考慮使用，這些試劑盒通常能夠適用於(yu) 不同類型的細胞樣本。然而，對於(yu) 組織樣本，需要注意不同的試劑盒樣本製備方法可能不同。使用TUNEL凋亡檢測試劑盒時，需製備石蠟或冷凍切片，而使用Caspase活性檢測試劑盒時，則需對組織進行機械剪碎、勻漿和裂解。
02
基於(yu) 實驗儀(yi) 器和配置選擇
不同凋亡檢測試劑盒的使用需要配備對應的儀(yi) 器。推薦您參考下方表格，根據實驗室現有的實驗儀(yi) 器，選擇合適的凋亡檢測試劑盒。需要提醒的是，除了確認儀(yi) 器是否可用，還需要了解實驗儀(yi) 器的具體(ti) 配置，例如流式細胞儀(yi) 的熒光檢測通道和熒光顯微鏡的濾光片組等。
市售的Annexin V凋亡檢測試劑盒和TUNEL凋亡檢測試劑盒，有多種熒光染料組合可供選擇。在選擇熒光染料時，需根據儀(yi) 器配置選擇能夠檢測的熒光染料。除此之外，如果您的細胞自帶熒光（如轉染了熒光蛋白的細胞或使用了帶熒光的藥物處理細胞），在儀(yi) 器配置允許的前提下，優(you) 先選擇與(yu) 細胞自發熒光不同檢測通道的熒光染料。如果受限於(yu) 儀(yi) 器配置條件，無法避免熒光染料光譜重疊，要注意合理設置單染管用於(yu) 調節補償(chang) ，以確保檢測結果的準確性。
試劑盒種類 | 檢測樣本 | 檢測儀(yi) 器 |
Annexin V凋亡檢測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 流式細胞儀(yi) 、熒光顯微鏡 |
TUNEL凋亡將測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 流式細胞儀(yi) |
細胞爬片/塗片、石蠟切片、冷凍切片 | 熒光顯微鏡 | |
Caspase活性檢測試劑盒 | 細胞、組織 | 分光光度計、酶標儀(yi) |
線粒體(ti) 膜電位（JC-1）檢測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 熒光顯微鏡、流式細胞儀(yi) |
以上是關(guan) 於(yu) 凋亡檢測試劑盒的知識科普及選擇指南，更多細胞培養(yang) 和檢測相關(guan) 幹貨，請持續關(guan) 注細胞學堂專(zhuan) 欄~
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