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巨噬細胞（Macrophages）是一種位於(yu) 組織內(nei) 的白血球，源自單核細胞，單核細胞來源於(yu) 骨髓中的前體(ti) 細胞。巨噬細胞在生物體(ti) 內(nei) 扮演著多重角色，它們(men) 可以吞噬和清除異物和衰老死亡細胞、分泌生物活性物質、調節血細胞生成和參與(yu) 免疫應答等，是一類在體(ti) 內(nei) 發揮重要免疫效應的細胞，並且也是實驗室最-常用的細胞種類之一。
骨髓來源巨噬細胞（Bone Marrow Derived Macrophage）是從(cong) 大鼠或者其他哺乳動物骨髓中的單個(ge) 核細胞經細胞因子誘導分化得到的一種原代巨噬細胞。本期，我們(men) 將以大鼠為(wei) 例，分享骨髓來源巨噬細胞分離提取和培養(yang) 注意事項，幫助您順利上手開展實驗。
分離提取步驟
一、分離脛骨和股骨
取2周齡的健康大鼠，斷頸法處死；
用超純水清洗大鼠2次，再用75%酒精浸泡5 min，進行表麵除菌處理；
將消毒後的動物轉運至超淨工作台內(nei) ；
無菌條件下，用第一套無菌剪刀和鑷子剪開腿部皮膚，充分暴露兩(liang) 側(ce) 股骨；
更換第二套無菌剪刀和鑷子，從(cong) 大腿根部關(guan) 節處和腳後跟關(guan) 節處剪斷，分離腿部肌肉，取出脛骨和股骨，將其放在含有PBS的培養(yang) 皿內(nei) 。
圖1. 分離的脛骨和股骨
二、衝(chong) 洗骨髓
更換第三套無菌剪刀和鑷子，清理脛骨和股骨表麵殘留的肌肉組織，注意保證骨頭完整；
留取純淨骨頭，將其轉移至新的含有PBS的培養(yang) 皿內(nei) ；
取一個(ge) 新培養(yang) 皿，加10 mL大鼠骨髓來源巨噬細胞完-全培養(yang) 基（貨號CM-R141）備用；
更換第四套無菌剪刀和鑷子，先用鑷子固定骨頭，再用無菌剪刀剪下骨頭兩(liang) 端；
用注射器吸取培養(yang) 皿內(nei) 的完-全培養(yang) 基，從(cong) 骨頭一端插入針頭，反複衝(chong) 洗骨髓至骨頭發白透亮，將骨髓液收集在培養(yang) 皿內(nei) ；
用5 mL移液槍反複吹打骨髓液，將骨髓液經200目細胞篩過濾，濾液收集於(yu) 離心管內(nei) ，離心棄上清，獲得骨髓細胞沉澱。
圖2. 注射器衝(chong) 洗骨髓
三、巨噬細胞誘導分化
用含M-CSF（巨噬細胞集落刺激因子）的培養(yang) 基刺激骨髓單個(ge) 核細胞分化為(wei) 巨噬細胞。
M-CSF有兩(liang) 種獲取方式：
購買(mai) 商品化的M-CSF因子（推薦貨號：PCK042、PCK043、PCK044、PCK303）。M-CSF的常用濃度範圍為(wei) 10-50 ng/mL，不同品牌的細胞因子使用濃度可能有所差異，需根據實際誘導效果調整使用濃度；
使用培養(yang) 5-7天的L-929細胞上清[1]。將獲得的L-929細胞培養(yang) 上清高速離心除雜，分裝後置於(yu) -20℃冷凍保存。通常使用含有20% L-929細胞上清的完-全培養(yang) 基進行誘導，同時可根據實際誘導效果，調整L-929細胞上清的含量。
圖3. 誘導完成的骨髓來源巨噬細胞
細胞培養(yang) 注意事項
骨髓來源巨噬細胞體(ti) 外培養(yang) 不增殖，需注意培養(yang) 時間，建議盡快進行相關(guan) 實驗；
骨髓來源巨噬細胞難消化，可用利多-卡因消化3 min左右（不建議超過5min），若細胞仍無法消化，更換消化液為(wei) 0.25%胰蛋白酶，或使用無菌細胞刮。
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