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神經幹細胞（NSCs）因具備獨-特的增殖能力與(yu) 多向分化潛能，在神經科學研究中發揮著重要作用。然而，在培養(yang) 神經幹細胞的過程中，科研人員常常會(hui) 遇到培養(yang) 要求高、分化控製難等挑戰。
那麽(me) ，如何選擇合適的培養(yang) 方式？不同培養(yang) 條件對細胞狀態有何影響？本文將深入介紹和解析神經幹細胞的培養(yang) 方法、誘導分化策略，並為(wei) 您解答常見實驗難題，助力您的研究更進一步！
神經幹細胞的基本介紹
神經幹細胞可以從(cong) 不同的組織中分離獲得，常見的來源有胚胎、大腦皮層、海馬體(ti) 和脊髓等。為(wei) 了在體(ti) 外成功培養(yang) 神經幹細胞，合適的培養(yang) 體(ti) 係至關(guan) 重要，培養(yang) 基的成分、添加劑的使用、培養(yang) 條件等因素都對神經幹細胞的增殖、存活以及分化狀態有著深遠的影響。
生長培養(yang) 基
常用配方：DMEM/F12 + B-27（不含維生素A）+ bFGF + EGF + 雙抗
為(wei) 更好地滿足神經幹細胞的培養(yang) 需求，普諾賽®提供經過配方優(you) 化的神經幹細胞完-全培養(yang) 基，助力您的神經幹細胞培養(yang) 工作更加高效、穩定。
培養(yang) 條件
氣相：空氣，95%；CO2，5%
溫度：37℃
神經幹細胞的培養(yang) 方法
神經幹細胞的培養(yang) 方法主要分為(wei) 懸浮培養(yang) 和貼壁培養(yang) 兩(liang) 大類，這兩(liang) 種方法各具特色，適用於(yu) 不同的研究需求。
懸浮培養(yang)
通過使用未經TC（Tissue Culture）處理、未包被或低吸附的培養(yang) 器皿和無血清培養(yang) 基進行培養(yang) ，自然形成神經幹細胞球。
貼壁培養(yang)
通過將神經幹細胞球消化分散成單個(ge) 細胞後，接種在經TC處理和包被的培養(yang) 器皿內(nei) ，用無血清培養(yang) 基進行培養(yang) ，形成貼壁生長的單層細胞。
懸浮培養(yang) 和貼壁培養(yang) 優(you) 缺點
懸浮培養(yang)
優(you) 點 | 缺點 |
可以形成穩定的神經球，保持未分化狀態，有利於(yu) 長期培養(yang) 和大規模擴增 | 易形成大細胞球，中心細胞易缺氧、缺營養(yang) 死亡 |
懸浮培養(yang) 早期增殖速率優(you) 於(yu) 貼壁培養(yang) | 懸浮培養(yang) 自噬體(ti) 形成增多，可能因為(wei) 神經球內(nei) 細胞營養(yang) 缺乏而激活自噬 |
培養(yang) 條件和方法簡單，分離培養(yang) 成功率高，離心或半量換液操作簡單 | 需要頻繁離心和重懸細胞，增加細胞損失 |
幹性維持能力更強，相比貼壁培養(yang) 不易分化 | 不利於(yu) 誘導分化和分化形態觀察 |
貼壁培養(yang)
優(you) 點 | 缺點 |
能形成形態規則的單層細胞，傳(chuan) 代損耗低，容易觀察到細胞形態和分化階段，更有助於(yu) 神經幹細胞的培養(yang) 和存儲(chu) | 長期培養(yang) 易自發分化 |
貼壁培養(yang) 的單層NSCs，與(yu) 培養(yang) 基接觸麵更大，誘導分化成功率更高 | |
貼壁培養(yang) 的NSCs經多次傳(chuan) 代培養(yang) 後仍可保持較強的增殖能力，同時具有多分化潛能的特性 | NSCs貼壁不牢，易脫落，需使用TC處理和包被的培養(yang) 器皿；細胞傳(chuan) 代操作複雜，傳(chuan) 代後易再次懸浮成球 |
貼壁培養(yang) 的NSCs自噬水平較低，有利於(yu) 維持細胞的穩定性和增殖能力 |
神經幹細胞的誘導分化
1）誘導分化為(wei) 星形膠質細胞
將神經幹細胞球體(ti) 消化分散後離心，使用星形膠質細胞誘導培養(yang) 基（DMEM高糖＋B-27，含維生素A＋N-2＋GlutaMAX＋FBS＋bFGF[1]）重懸細胞，鋪入多聚賴氨酸包被的培養(yang) 瓶內(nei) 培養(yang) 。隨著誘導分化的進行，神經幹細胞逐漸轉變為(wei) 星形膠質細胞，其形態變化如圖1所示。
圖1. 神經幹細胞誘導分化為(wei) 星形膠質細胞的形態變化
2）誘導分化為(wei) 少突膠質細胞
與(yu) 星形膠質細胞誘導方法類似，使用少突膠質細胞誘導培養(yang) 基（DMEM/F12＋B-27，含維生素A＋EGF＋bFGF＋T3＋胰島素[2]）誘導神經幹細胞分化為(wei) 少突膠質細胞，其形態變化如圖2所示。
圖2. 神經幹細胞誘導分化為(wei) 少突膠質細胞的形態變化
3）誘導分化為(wei) 神經元細胞
將神經幹細胞球體(ti) 消化分散後離心，使用神經元細胞誘導培養(yang) 基（Neurobasal神經元培養(yang) 基+1% N-2+2% B-27含維生素A+NEAA+β巰基乙醇+L-穀氨酰胺）重懸細胞，鋪入多聚賴氨酸包被的培養(yang) 瓶內(nei) 培養(yang) 。培養(yang) 6天後，在神經元細胞誘導培養(yang) 基中加入10 ng/mL GDNF和10 ng/mL BDNF，以進一步促進神經元的分化[3]。
神經幹細胞培養(yang) 常見問題解答
1）
如何準確判斷神經幹細胞的傳(chuan) 代時機？
神經幹細胞傳(chuan) 代時機需根據神經幹細胞球的大小和形態判斷。應讓神經幹細胞球中間保持明亮，避免細胞球生長過大。如圖3所示，右下角神經幹細胞球體(ti) 過大，球中部發暗，應該在這種狀態出現之前進行傳(chuan) 代。一般而言，神經幹細胞進行1:2傳(chuan) 代後，大約2-3天可再次傳(chuan) 代。
圖3. 神經幹細胞球生長形態
2）
神經幹細胞較難消化成單個(ge) 細胞，是否必須完-全消化？
在懸浮培養(yang) 神經幹細胞時，無需將神經幹細胞球徹-底消化至單個(ge) 細胞狀態。而貼壁培養(yang) 神經幹細胞時，需將其消化分散成單個(ge) 細胞，這樣更利於(yu) 細胞的貼壁生長（如圖4）。在此過程中，推薦使用Accutase酶，相較於(yu) 常用的胰酶，Accutase酶消化作用更為(wei) 溫和，能夠顯著降低對細胞的損傷(shang) 風險。
圖4. 使用Accutase酶消化成單細胞接種圖
3）
懸浮培養(yang) 神經幹細胞，如何進行換液？
建議采用半量換液法進行操作，具體(ti) 操作步驟如下：將培養(yang) 瓶豎直靜置，待大部分細胞自然沉降後，吸棄原培養(yang) 體(ti) 積一半的細胞培養(yang) 上清液，補加等體(ti) 積新鮮培養(yang) 基繼續培養(yang) 。為(wei) 減少細胞損失，可將培養(yang) 上清轉移至離心管中，使用離心機500 rpm離心5 min後，棄去上清，用等體(ti) 積新鮮培養(yang) 基重懸細胞，放回原瓶繼續培養(yang) 。
無論是懸浮培養(yang) 還是貼壁培養(yang) ，都各有優(you) 缺點，科研人員可根據實驗需求選擇合適的方法。此外，掌握正確的誘導分化策略和優(you) 化培養(yang) 條件，能夠有效提升神經幹細胞的培養(yang) 成功率。
希望本篇指南能為(wei) 您的實驗提供實用參考，如有更多疑問，歡迎留言交流！更多細胞培養(yang) 幹貨，請持續關(guan) 注細胞學堂專(zhuan) 欄~
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參考文獻
[1]
Sardar D, Lozzi B, Woo J, et al. Mapping Astrocyte Transcriptional Signatures in Response to Neuroactive Compounds[J]. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(8):3975.
[2]
楊慧敏. 新生大鼠神經幹細胞定向分化為(wei) 少突膠質細胞的實驗研究[D]. 重慶醫科大學, 2006.
[3]
李登賀. 神經幹細胞定向分化為(wei) 中間神經元的研究[D]. 昆明理工大學, 2016.
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